Multiplexed absolute quantification of blood plasma proteins using targeted proteomics

QC 2022-05-16

Abstract

Proteiner är de molekylära byggstenar som bygger upp alla levande organismer. De utgör både funktionella och strukturella komponenter i vävnader och deltar i aktiviteter som metabolism och kommunikation. Deras nivåer varierar och beror på kroppens fysiologiska tillstånd, men också på olika sjukdomar. Blodplasma, vilket är den flytande komponenten av blod, är den vätska som är i kontakt med alla människokroppens organ. Detta gör blodplasma till en utmärkt källa att studera då den innehåller information som representerar de olika biologiska processer som sker. Det är dock svårt att studera proteiner i blod på grund den höga komplexiteten som kommer från stora koncentrationsskillnader hos olika protein. Riktad proteomik är en teknologi som trots detta kan tillgodogöra sig denna typ av information. Tekniken möjliggör träffsäker koncentrationsbestämning genom att använda sig av tunga isotopinmärkta standarder som mäts med hjälp av vätskekromatografi i kombination med tandemmasspektrometri. Även mycket små skillnader i proteinkoncentrationer kan upptäckas med tekniken tack vare den höga kvantitativa träffsäkerheten. Analyserna kan utföras parallellt och flera analyter kan mätas samtidigt (multiplex). I detta examensarbete beskriver jag våra insatser för att utveckla och använda en helt ny teknologisk plattform inom området för riktad proteomik som vi har utvecklat för kliniska tillämpningar som ofta associeras med mycket höga krav på noggrannhet och pålitlighet.

I Artikel I genomfördes en rigorös djupdykning för att analysera en resurs av proteinstandarder som producerats inom The Human Protein Atlas. Studien beskriver experimentella kromatografiska koordinater för över 25 000 proteotypiska peptider från 10 000 individuella proteinstandarder. För att påvisa användbarheten kvantifierades och koncentrationsbestämdes även 23 proteiner i blodplasma. Resultatet möjliggjorde att specifika kluster av personer kunde urskiljas baserat på deras LPA-, APOE-, SERPINA5- och TFRC-nivåer.

Artikel II bygger på observationerna från Artikel I och använder sig av teknologin för att kvantifiera proteinkoncentrationer i en väldefinierad kohort beståendes av 94 individer. Dessa blodprov hade samplats in över ett års tid vid fyra olika tidpunkter. Den longitudinella proteinprofileringen möjliggjorde en bedömning av variationen inom plasmaproteomet för de individer som studerades. Den tillämpade analysen inkluderade 52 målproteiner med huvudsakligen aktivt utsöndrade leverproteiner och hela 21 FDA-godkända målprotein. Resultaten för APOA1 och APOB visade hög korrelation med sina motsvarande kliniska analyser. Detta tyder på att riktad proteomik och multiplex proteinkvantifiering har en hög potential och kan ses som ett lovande alternativ till antikroppsbaserade analyser.

I Artikel III genomgick de isotopinmärkta standarderna en grundlig utredning med avseende på deras stabilitet och reproducerbarhet. Dessutom utarbetades en ny formulering av standarder. Här förvarades standarderna i kaotropiska medel som vakuumtorkades ner innan användning. Detta möjliggjorde protokoll baserade på enbart tillsatser av reagens, vilket möjliggör uppskalning med ökad reproducerbarhet, men det möjliggör även lagring i rumstemperatur i upp en månad med bibehållen analytisk prestanda. Det nya arbetsflödet användes för multiplex kvantifiering av 100 kliniskt relevanta målprotein i blodplasma som kvantifierades genom att mäta 300 peptider med medianvariationskoefficient under 10 %.

Arbetet i Artikel IV expanderar Artikel III ytterligare och tillämpar tekniken för att profilera 1800 individer i en övergripande studie beståendes av flera olika cancertyper. Blodplasma hade samlats in från individer som diagnosticerats med en av 15 cancertyper. Den slutgiltiga analysen pågick under fyra månader och riktade in sig mot 253 proteiner och kunde kvantifieras med låg variation baserat på 1013 peptider. Flera potentiella biomarkörer för Multipelt myelom identifierades, där de tre mest lovande analyterna bestod av komplementkomplexet C1, JCHAIN och CD5L.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-312258