3D super-resolution microscopy of living cells using reversibly switchable fluorophores

Abstract

Traditionella mikroskopitekniker har, till följd av ljusets vågegenskaper, en begränsad upplösning. Detta innebär att objekt som befinner sig närmre varandra är cirka 200 nm inte kan särskiljas eftersom bilderna är suddiga. Superupplösta mikroskopitekniker kringgår denna begränsning genom att utnyttja specifika interaktioner mellan ljus och fluorescerande molekyler för att koda in mer detaljerat spatiell information in i den inhämtade datan. Dagens superupplösta tekniker innebär dock ofta en ökad komplexitet i förberedelsen av proven samt mer energikrävande, tidskrävande och invasiva avbildningsekvenser. Detta tillsammans gör många av dessa tekniker dåligt lämpade för avbildning av levande celler. Eftersom många biologiska studier bygger på högupplöst data med tredimensionell och dynamisk information är det viktigt att nya tekniker utvecklas för att inhämta sådan data. Med detta arbete tar vi flera viktiga steg mot detta mål genom att utnyttja reversibelt omställningsbara fluorescerande proteiner tillsammans nya belysningsmönster som möjliggör parallelliserad datainhämtning. Även belysningsmönster med låg intensitet kan få proteinerna att inta fluorescerande eller ickefluorescerande tillstånd och genererar emissionsmönster som förmedlar information om provets små detaljer i alla tre spatiella dimensioner.  Genom att använda omkopplingsbara proteiner i ett parallelliserat avbildningssystem så kan bildsekvenser som sträcker sig över lång tid med hög temporal upplösning skapas med endast låga ljusintensiteter. Utöver dessa nya avbildningssekvenser presenterar vi också ett teoretiskt ramverk för att modellera den påverkan som de omställningsbara proteinernas egenskaper, samt olika avbildningsparametrar, har på den slutliga bildkvaliteten. Vi förutspår och undersöker effekten av inmärkningsdensitet och fotoblekning på enstaka bilder och bildsekvenser med beaktande av den stokastisitet som kopplas till dessa fenomen. Vi presenterar också en ny familj av reversibelt omkopplingsbara proteiner som styrs med rödare våglängder och som kan avbildas helt utan ljus nära den ultravioletta delen av spektrat, vilket möjliggör ännu mindre invasiv avbildning. Detta arbete ämnar inte bara att förse med nya verktyg för avbildning, utan också bidra till en bättre förståelse för de underliggande principerna och att främja framtida utveckling av superupplösta mikroskopitekniker för avbildning inom biologiska tillämpningar.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-300760